| Биологическая роль и механизмы апоптоза |
|
Галушкин Алексей Владимирович группа 342 СПБГПМА
Апоптоз как физическое явление известен давно. Апоптоз — явление программируемой клеточной смерти, сопровождаемой набором характерных цитологических признаков (маркеров апоптоза) и молекулярных процессов, имеющих различия у одноклеточных и многоклеточных организмов. Апоптоз — форма гибели клетки, проявляющаяся в уменьшении её размера, конденсации и фрагментации хроматина, уплотнении наружной и цитоплазматической мембран без выхода содержимого клетки в окружающую среду. Основная биологическая роль апоптоза состоит в том, чтобы устанавливать равновесие между пролиферацией и гибелью клеток. Примеры апоптоза клеток в организме В процессе онтогенеза и эмбриогенеза. Апоптоз играет жизненно важную роль в процессе эмбрионального и онтогенетического развития. Он наблюдается при различных морфогенетических процессах. В тканях взрослого организма. Во взрослом организме апоптоз распространен в различных типах тканей. Он встречается как в медленно пролиферирующей популяции клеток (гепатоциты, клетки эпителия коры надпочечников), так и в быстро пролиферирующих клеточных популяциях. В первом случае он выполняет функцию гомеостатичсской регуляции оптимального объема ткани. Во втором случае роль апоптоза, в основном, связана с дифференцировкой клеток. При патологических состояниях. Апоптотическая гибель клеток наблюдается при различных патологических состояниях. Этим путем осуществляется гибель клеток в эндокринно-зависимых тканях, при уменьшении концентрации соответствующего гормона (например, клеток простаты после кастрации и коры надпочечников после подавления синтеза АКТГ глюкокортикоидами). Гибель клеток путем апоптоза происходит также при уменьшении кровоснабжения органа (ишемическая болезнь сердца). Путем программированной клеточной гибели происходит удаление клеток, выживание которых нежелательно для организма, например мутантных клеток или клеток, зараженных вирусом. В последнем случае этот процесс имеет важное биологическое значение, поскольку фрагментация ДНК предупреждает перенос генетического материала в другие клетки. Воздействие радиации вызывает апоптоз в пролиферирующих клетках эпителия кишечника и в непролиферирующих клетках иммунной системы. Т.е. апоптоз является широко распространенным общебиологическим механизмом, ответственным за поддержание постоянства численности клеток, формообразование, выбраковку дефектных клеток. Различные пути гибели клетки. Апоптоз как явление впервые был описан морфологами. Основываясь на микроскопической картине гибнущей клетки, они установили, что клетки погибают, по крайней мере, двумя путями: некроз и апоптоз. При некрозе клетки набухают, их митохондрии и другие органеллы расширяются (вследствие нарушения работы ионных каналов) и разрываются внутриклеточные и плазматическая мембраны клетки . В результате этого активируются лизосомальные ферменты, а внутриклеточное содержимое, попадая во внеклеточную среду, вызывает воспалительные процессы. Классические причины, приводящие к некрозу клетки -гипертермия, ингибирование окислительного фосфорилирования, гликолиза или цикла Кребса, гипоксия, действие комплемента или различных токсинов. Отличительной морфологической чертой апоптоза является коллапс ядра. Хроматин, который в норме представлен открытыми и конденсированными областями (гетеро- и эухроматин), становится суперконденсированным в форме полумесяца по периферии ядра. В этот момент начинается фрагментация ДНК. На ранних стадиях апоптоза, в отличии от некроза, клетка наоборот, сморщивается, теряя до 1/3 своего объема за несколько минут. Механизм этого явления до сих пор не изучен, но, несомненно, в этот процесс должны вовлекаться транспорт ионов и воды. Важной особенностью этого процесса является то, что не происходит повреждения мембран клетки. Усыхание хорошо выражено как в культуре клеток, так и в тканевых срезах, где апоптотическая клетка отделяется от соседних клеток. Далее апоптотическая клетка превращается в совокупность окруженных мембраной апоптозных телец различных по своему составу, которые фагоцитируются макрофагами или соседними клетками. Клетка на данном этапе еще живая (включение летального красителя трипанового синего не происходит). Видимо в этом и есть задача апоптоза - утилизация еще живых апоптозных телец, пока содержимое клетки не попадает во внеклеточную среду, не вызывая воспалительных явлений. Т.е. уничтожение клеток путем апоптоза обеспечивает минимальное повреждение тканей по сравнению с другими механизмами смерти. Молекулярно-генетические аспекты апоптоза. Существует несколько путей реализации апоптоза. 1. Важное место занимает путь, опосредованный физиологическими индукторами, действие которых реализуется через клеточные рецепторы, специально предназначенные для включения программы апоптоза. Этот путь передачи сигнала запрограммированной клеточной смерти схематически можно изобразить следующим образом: индукторы ==> рецепторы ==> адаптеры ==> инициирующие каспазы ==> регуляторы ==> эффекторные или казнящие каспазы. Так, рецептор, обозначаемый Fas, взаимодействуя с соответствующим лигандом (лигандом FasL), трансмембранным белком Т-киллера, активируется и запускает программу смерти клетки, инфицированной вирусом. Тем же путем при взаимодействии с лигандом FasL на поверхности ТН-1-лимфоцитов или с антителом к Fas-рецептору погибают ставшие ненужными выздоровевшему организму В лимфоциты, продуценты антител, несущие Fas-рецептор. FasL- лиганд, относящийся к многочисленному семейству фактора некроза опухолей (TNF - tumor necrosis factor). Это семейство гомотримерных лигандов, кроме FasL и TNFa , включает TNFb (лимфотоксин), TRAIL (Apo2L), CD40L, CD27L, CD30L, OX40L. Fas - член семейства рецепторов TNF. Все они представлены трансмембранными белками, которые внеклеточными участками взаимодействуют с тримерами лигандов-индукторов. Взаимодействие рецептора и лиганда приводит к образованию кластеров рецепторных молекул и связыванию их внутриклеточных участков с адаптерами. Адаптер, связавшись с рецептором, вступает во взаимодействие с эффекторами, пока еще неактивными предшественниками протеаз из семейства инициирующих каспаз. Взаимодействие адаптера с рецептором и эффектором осуществляется через гомофильные белок-белковые взаимодействия небольших доменов: DD (death domain - домен смерти), DED (death-effector domain - домен эффектора смерти), CARD (caspase activation and recruitment domain - домен активации и рекрутирования каспазы). Все они имеют сходную структуру, содержат по шесть a-спиральных участков. Домены DD участвуют во взаимодействии рецептора Fas c адаптером FADD (Fas-associated DD- protein) и во взаимодействии рецепторов TNFR1 и DR3 (death receptor 3) с адаптером TRADD (TNFR1-associated DD-protein). Домены DED участвуют во взаимодействии адаптера FADD с прокаспазами 8 и 10. Адаптер RAIDD (RIP-associated Ich-1/CED-3 homologous protein with a death domain, RIP - receptor interacting protein) связывается с прокаспазой-2 через CARD-домены. Наиболее подробно охарактеризована прокаспаза-8 (FLICE/MACH/Mch5), рекрутируемая рецептором Fas через адаптeр FADD. Образуются агрегаты FasL - Fas - FADD - прокаспаза-8. Подобные агрегаты, в которых происходит активация каспаз, называются апоптосомами, апоптозными шаперонами, или сигнальными комплексами, индуцирующими смерть (DISC - death-inducing signaling complex). Каспазы - семейство цистеиновых протеиназ, расщепляющих свои субстраты по остаткам аспартатовой кислоты. Каспазы присутствуют в цитоплазме в виде проэнзимов и активируются до полностью функциональных протеаз путем расщепления проэнзима на большую и малую субединицы и дальнейшего отщепления от них N-концевых доменов. Затем субъединицы собираются в тетрамер с двумя активными центрами. Расщепление прокаспаз могут осуществлять различные протеазы, в том числе и другие каспазы. По выполняемой каспазами функции их можно разделить на две основные группы: инициаторные каспазы (8, 9 и10) и вторая группа - эффекторные каспазы (3, 6 и 7). После того, как каспазы из первой группы активируют эффекторные каспазы, процесс, запущенный программой смерти, оказывается необратимым. Расщепление 3, 6 и 7 каспазами ряда ключевых субстратов, в частности DFF45/ICAD - ингибитора нуклеазы DFF40/CAD (осуществляется каспазой 3), ламинов - ядерных цитоскелетных белков (осуществляется каспазой 6) и т.д., приводит к фрагментации ДНК и деструкции клетки. Существуют другие пути активации каспазы-8 - с участием рецепторов TNFR1 и DR3. Однако эти пути, включаемые одним и тем же адаптером TRADD, конкурируют с параллельными путями активации ядерных факторов транскрипции NF-єB (nuclear factor kappa B) и JNK/AP-1 (JNK, Jun-N-концевая киназа, является компонентом митоген-активируемого киназного пути, ведущего к активации фактора транскрипции AP-1), зависимыми от адаптеров RIP и TRAF (TNFR1-associated factor), под контролем этих факторов транскрипции находится синтез белковых регуляторов, которые блокируют TNF- или Apo3L-индуцированную активацию каспазы-8. 2. Существует путь передачи сигнала апоптоза с участием эндоплазматического ретикулума (ЭР). В ЭР локализована прокаспаза-12. Нарушение внутриклеточного Ca2+- гомеостаза добавкой тапсигаргина или Ca2+-ионофорного антибиотика А23187 ведет к апоптозу клеток, вызванному превращением прокаспазы-12 в каспазу-12. ЭР-зависимый апоптоз связан с болезнью Альцгеймера: кортикальные нейроны мышей, дефицитных по каспазе-12, устойчивы к апоптозу, индуцированному І-амилоидным белком, но не к апоптозу с участием рецепторов плазматической мембраны или митохондриального цитохрома С. 3. Цитотоксические лимфоциты, Т-киллеры, могут вызывать апоптоз у инфицированных клеток с помощью белка перфорина. Полимеризуясь, перфорин образует в цитоплазматической мембране клетки-мишени трансмембранные каналы, по которым внутрь клетки поступают TNFb , гранзимы (фрагментины) - смесь сериновых протеаз. Существенным компонентом этой смеси является гранзим В - протеолитический фермент, превращающий прокаспазу-3 в активную каспазу-3. 4. Высвобождаемый из митохондрий цитохром С вместе с цитоплазматическим фактором APAF-1 (apoptosis protease activating factor-1) участвует в активации каспазы- 9. APAF-1 - белок с молекулярной массой 130 кДа, содержащий CARD-домен (caspase activation and recruitment domain) на N-конце и 12 повторяющихся аминокислотных WD-40-последовательностей (WD - дипептид из триптофана и аспартата) на С-конце, образует комплекс с прокаспазой-9 в присутствии цитохрома С и dATP или АТР. К наиболее охарактеризованным WD-белкам относится ?-cубъединица G-белков. Из этих субъединиц собираются жесткие, симметричные структуры, наподобие веера или пропеллера. WD-повторы свойственны белкам, участвующим в регуляции деления и дифференцировки эукариотических клеток, транскрипции генов, модификации мРНК, трансмембранной передачи сигналов, слияния мембранных везикул. Среди прокариот WD-белки обнаружены у цианобактерий. APAF-1 играет роль арматуры, на которой происходит аутокаталитический процессинг каспазы-9. Предполагается, что в результате зависимого от гидролиза dATP (или АТР) конформационного изменения APAF-1 приобретает способность связывать цитохром С. Связав цитохром С, APAF-1 претерпевает дальнейшее конформационное изменение, способствующее его олигомеризации и открывающее доступ CARD-домена APAF-1 для прокаспазы-9, которая тоже содержит CARD-домен. Так образуется конструкция, называемая тоже апоптосомой, с молекулярной массой > 1,3 млн дальтон, в составе которой - не менее 8 субъединиц APAF- 1. Благодаря гомофильному CARD-CARD-взаимодействию с APAF-1 в эквимолярном соотношении связывается прокаспаза-9, а затем прокаспаза-9 связывает прокаспазу-3. Пространственное сближение молекул прокаспазы-9 на мультимерной арматуре из APAF-1-цитохром-С-комплексов, по-видимому, приводит к межмолекулярному протеолитическому процессингу прокаспазы-9 с образованием активной каспазы-9. Сходный механизм предложен для активации прокаспазы CED-3 у нематоды Caenorhabditis elegans - аналога прокаспазы-9 млекопитающих. Альтернативный вариант - прокаспаза-9, связавшись с апоптосомой, может принять конформацию, которая приводит к внутримолекулярному процессингу (самоактивации). Зрелая каспаза-9 затем расщепляет и активирует прокаспазу-3. Мутантный APAF-1, лишенный WD-40-повторов, активирует прокаспазу-9, но не способен к рекрутированию и активации прокаспазы-3. Флавопротеин AIF, будучи добавленным к изолированным ядрам из клеток HeLa, вызывает конденсацию хроматина и фрагментацию ДНК, а при добавлении к изолированным митохондриям печени крыс - высвобождение цитохрома С и каспазы-9. Микроинъекция AIF в интактные фибробласты крыс приводит к конденсации хроматина по переферии ядра, разрыву ДНК на крупные фрагменты длиной 50 т.п.н. и больше, снижению мембранного потенциала в митохондриях и переходу фосфатидилсерина из внутреннего слоя цитоплазматической мембраны в наружний. Ни один из этих эффектов AIF не предотвращается пептидным ингибитором каспаз N-бензоилоксикарбонил-Val-Ala-Asp.трифторметилкетоном (Z-VAD.fmk), который предотвращает апоптоз, индуцированный микроинъецированным цитохромом С. Эти данные показывают, что AIF является митохондриальным эффектором апоптоза у животных, действующим независимо от каспаз (Susin S. A. et al, 1999). Кроме рассмотренных компонентов, при нарушении наружной мембраны митохондрий из межмембранного объема выделяется термолабильный фактор, вызывающий необратимое превращение ксантиндегидрогеназы в ксантиноксидазу. Фактор устойчив к ряду испытанных ингибиторов протеаз, включая каспазы, сериновые и металлопротеазы. Ксантиндегидрогеназа катализирует зависимое от NAD+ окисление ксантина до гипоксантина и последующее окисление гипоксантина до мочевой кислоты. Ксантиноксидаза катализирует те же реакции, но не с NAD+, а с О2 в качестве акцептора электронов. При этом образуются О2A, Н2О2, а из них - и другие активные формы кислорода (АФК), которые разрушают митохондрии и являются мощными индукторами апоптоза. Механизмы образования АФК, конечно, не ограничиваются ксантиноксидазной реакцией. Главным источником АФК в клетках являются митохондрии. Резкое увеличение АФК происходит при возрастании мембранного потенциала в митохондриях, когда снижено потребление ATP и скорость дыхания лимитируется ADP. Доля электронного потока через дыхательную цепь митохондрий, идущая на образование О2A, достигает 1-5 %. Цитоплазматическая мембрана макрофагов и нейтрофилов, как уже отмечалось, содержит О2A - генерирующую NADPH-оксидазу. В зависимости от пути, по которому осуществляется активация каспаз, различают несколько типов клеток. Клетки типа I (в частности, линия лимфобластоидных В-клеток SKW и T-клетки линии Н9) подвергаются программированной гибели по пути, зависимому от апоптозных рецепторов плазматической мембраны без участия митохондриальных белков. Клетки типа II (например, линии Т-клеток Jurkat и СЕМ) погибают по пути апоптоза, зависимому от митохондриального цитохр |
